氯對紫外線滅活枯草芽孢桿菌協(xié)同作用研究

張永吉 ,劉文君
（清華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系, 北京 100084）

　　摘要: 以枯草芽孢桿菌為研究對象，研究了紫外線和氯單獨(dú)及聯(lián)合作用時的滅菌效果。研究結(jié)果表明，單獨(dú)氯消毒時，對枯草芽孢桿菌的滅活效果很低，CT值為300mg·min/L時，滅活率僅為0.53個對數(shù)級，單獨(dú)紫外線消毒對枯草芽孢桿菌有較好的滅活效果，紫外線劑量為40mJ·cm-2時，對其有3.3個對數(shù)級的滅活效果；紫外線和氯聯(lián)合消毒時，對枯草芽孢桿菌的滅活效果大大增強(qiáng)，當(dāng)紫外線劑量為40mJ·cm-2，氯投量為300mg·min/L時，滅活率可達(dá)6.2個對數(shù)級，高于二者單獨(dú)作用效果之和。紫外線與氯的作用順序?qū)ο拘Ч忻黠@影響，以先紫外線照射然后再加氯的效果最好。通過Berenbaum公式計(jì)算可知，紫外線與氯聯(lián)合滅菌是協(xié)同作用，隨著紫外線劑量及氯投量的增加，協(xié)同作用增強(qiáng)。
　　關(guān)鍵詞: 紫外線; 氯; 消毒; 枯草芽胞桿菌; 協(xié)同作用

Research on synergistic disinfection of Bacillus subtilis by UV irradiation plus chlorine

ZHANG Yong-ji ,LIU Wen-jun
（Department of Environmental Science and Engineering, Tsinghua University, Peking 100084, ）

Abstract : The inactivation effect of Bacillus Subtilis was studied in the article, both UV irradiation and chlorine disinfection individual and combined application process was examined with laboratory water samples. Results showed that only 0.53 log10 reduction by chlorine CT of 300mg·min/L, UV irradiation was more effective compared with chlorination, UV dose of 40mJ·cm-2 resulted in 3.3 log10 reduction. Up to 6.2 log10 reduction were achieved with a UV dose of 40 mJ·cm-2 followed by chlorine CT of 300mg·min/L. The calculation from the Berenbaum formula verified that the effect on reducing the bacteria is synergistic effect of the combined applications of UV irradiation and chlorine.

Key words: ultraviolet irradiate; chlorine; disinfection; bacteria; Bacillus subtilis; synergism

　　氯消毒工藝用于飲用水消毒已經(jīng)有近百年的歷史，在保護(hù)人體健康方面發(fā)揮了重要的作用。但由于氯消毒會產(chǎn)生對人體健康具有危害作用的三鹵甲烷、鹵乙酸等消毒副產(chǎn)物^[1]，并且對一些具有抗氯性的原生動物如賈第蟲、隱孢子蟲等的殺滅效果很低，人們開始尋求消毒效果好，更加安全可靠的替代消毒技術(shù)^[2]。紫外線消毒由于消毒效果好、不需要投加化學(xué)藥劑、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)近些年來備受人們的關(guān)注。由于紫外線消毒在環(huán)保及人身安全方面的突出優(yōu)點(diǎn)，歐洲及北美的許多國家將UV消毒列為用水終端（POU）和用戶進(jìn)水端（POE）及小型給水系統(tǒng)中的首選方法。尤其是自從發(fā)現(xiàn)自來水中存在隱孢子蟲以后，美國已經(jīng)將紫外消毒工藝作為自來水消毒的最佳手段寫入供水法規(guī)中^[3]。在國外，應(yīng)用紫外線消毒的水廠越來來越多，近些年來我國也有一些水廠采用或正擬采用紫外線進(jìn)行自來水的消毒^[4]。
　　水中的一些微生物對紫外線具有較強(qiáng)的抵抗能力，枯草芽孢桿菌通常被用來作為一些難于被消毒劑殺死的微生物的代表，如有研究將枯草芽孢桿菌替代賈第蟲、隱孢子蟲來研究消毒劑的消毒效果。對于這種采用一種消毒劑難以滅活的微生物，通常采用協(xié)同消毒的方式對其進(jìn)行滅活，如臭氧協(xié)同氯、氯胺或者二氧化氯協(xié)同氯及氯與一些金屬離子的協(xié)同消毒，取得了較好的效果^[5-10]。而目前的研究主要集中在紫外線單獨(dú)對微生物的滅活效果，而研究氯對紫外線滅活水中難滅活微生物的影響的研究還較少，本文對紫外線和氯單獨(dú)及聯(lián)用的作用效果及作用的方式進(jìn)行了探討。

1．試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)水樣
　　枯草芽孢桿菌由中科院微生物所提供，使用時將枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，經(jīng)6000轉(zhuǎn)/min的速度離心10min，棄去上清液，將沉淀物重新溶解于一定量的無菌生理鹽水中，配制成一定濃度的細(xì)菌溶液備用。
1.2 試驗(yàn)儀器
　　準(zhǔn)平行光束儀（（collimated beam apparatus, 福建新大陸公司生產(chǎn)） 該裝置是將紫外燈管安裝在一個封閉的圓柱體內(nèi)，在筒體的底部中央開口，下方接一段長度為60cm，直徑為8.8cm的圓管，其作用是產(chǎn)生平行紫外線，使得紫外線能夠垂直到達(dá)樣品的表面^[11]。紫外燈管的功率40W，其中輸出254nm波長紫外線的功率為13.8W。紫外線強(qiáng)度用UV-B型紫外輻照計(jì)（北京師范大學(xué)科學(xué)儀器廠生產(chǎn)）測定。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 紫外線消毒
　　在Ф90mm的培養(yǎng)皿中放入40mL試驗(yàn)水樣，放在準(zhǔn)平行光束儀輻照窗下的磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌，打開遮光板照射一定時間后關(guān)閉遮光板，然后進(jìn)行微生物檢測，以未輻射的樣品作為對照計(jì)算枯草芽胞桿菌的滅活率，枯草芽胞桿菌的數(shù)量采用平板計(jì)數(shù)測定。
　　紫外線劑量的計(jì)算方法如下：

　　　　　　　　　　　　　 （1）

　　I0-樣品表面紫外線強(qiáng)度，由紫外輻照計(jì)在輻照窗口下不同位置平均值測得（mw/cm²）
　　α-樣品的紫外吸光度
　　d-樣品的深度（mm）

　　Dose=I ·t　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 （2）

　　Dose-紫外線劑量（mJ/cm²）

　　I-平均紫外強(qiáng)度（mw/cm²）

　　t-照射時間（S）

1.3.2 氯消毒
　　消毒劑是由分析純NaClO與無氨高純水配制而成，使用前用DPD法檢測其氯濃度。在500mL棕色試劑瓶中加入300mL試驗(yàn)水樣和5mL磷酸鹽緩沖溶液，投加一定量氯達(dá)到所需CT值后取樣，加入一定量的無菌10%的Na₂S₂O₃中止反應(yīng)，留作進(jìn)行微生物檢測。
1.3.3 紫外線協(xié)同氯消毒
　　方法同1.3.2和1.3.3。
1.4 消毒效果評價
　　消毒效果依據(jù)不同紫外劑量下水樣中微生物的滅活率來計(jì)算：

　　滅活率=lg（N_o/N_t）　　　　　　　　　　　　　　　 （3）

式中: N_o為消毒前水樣中對照微生物個數(shù)；
　　 N_t為紫外線照射一定時間后等量水樣中剩余微生物個數(shù)。

　　 對紫外線與氯聯(lián)合作用方式的判定根據(jù)Berenbaum公式來判斷^[12]。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 （5）

式中：x_i為達(dá)到一定消毒效果時各組分的濃度;
　　 y_i為各組分單獨(dú)使用時產(chǎn)生與混合物同樣效果時的濃度。
　　 如果兩種消毒劑間不存在相互作用關(guān)系，該式的值為1;
　　 如計(jì)算結(jié)果<1說明兩種消毒劑之間為協(xié)同作用;如果計(jì)算結(jié)果>1，為拮抗作用。

2．試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1紫外線對枯草芽孢桿菌的滅活效果
　 圖1是單獨(dú)紫外線消毒時，對枯草芽孢桿菌的滅活情況，并與大腸桿菌的滅活效果進(jìn)行了對比。從圖中可以看出，在達(dá)到同樣的滅活效果時，枯草芽孢桿菌所需的紫外線劑量要明顯高于大腸桿菌，如紫外線劑量為10mJ/cm²時，對大腸桿菌的滅活率為3.2個對數(shù)級，而對枯草芽孢桿菌的滅活只有0.43個對數(shù)級，紫外線劑量為30mJ/cm²時大腸桿菌的滅活為6.4個對數(shù)級，而對枯草芽孢桿菌的滅活僅有2.44個對數(shù)級。可見，枯草芽孢桿菌對紫外線具有較高的抗性，這與芽孢本身的特性有關(guān)，芽孢是某些細(xì)菌抵抗不良環(huán)境而產(chǎn)生的休眠體，此時細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，不進(jìn)行代謝，細(xì)胞壁比較致密，對溫度、pH、輻射等不良因素具有極強(qiáng)的抵抗能力，紫外線對其的滅活效果較低。

圖1紫外線對枯草芽孢桿菌的滅活效果
Fig.1 Effect of UV irradiation on reduction of Bacillus subtilis spores

2.2 氯對枯草桿菌的滅活效果
　　圖2是氯消毒對枯草芽孢桿菌的滅活情況。單獨(dú)氯消毒對枯草芽孢桿菌的滅活效率非常低，在常規(guī)的CT值范圍內(nèi)，滅活效果不明顯，如當(dāng)CT值為100mg·min/L時，滅活率僅為0.2個對數(shù)級，300mg·min/L時的滅活率也僅為0.53個對數(shù)級，可見，枯草芽孢菌對氯具有極強(qiáng)的抗性，這也是一些研究者用枯草芽孢桿菌來代替隱孢子蟲進(jìn)行研究其滅活規(guī)律的原因。在實(shí)際應(yīng)用中，要達(dá)到相應(yīng)的滅活效果，就必須提高加氯量，而這樣會增加出水中鹵代有機(jī)物的含量。因而對這種難以滅活的微生物，可以考慮其它的替代消毒技術(shù)及與其它技術(shù)聯(lián)用的方法，可以取得更好的消毒效果。

圖2 氯對枯草芽孢桿菌的滅活效果
Fig.2 Effect of chlorine on reduction of Bacillus subtilis spores

2.3 紫外線與氯聯(lián)用對枯草芽孢桿菌的滅活效果
　　紫外線與氯的先后作用方式可能會影響到二者聯(lián)合作用的效果。首先考察了先用紫外線照射后，再用氯進(jìn)行消毒對枯草芽孢桿菌的滅活情況。從圖3中可以看出，兩者聯(lián)用的效果與紫外線的劑量和氯的CT值有關(guān)。如紫外線劑量為10 mJ·cm^-2，氯的CT值為50mg·min/L時，對枯草芽孢桿菌的滅活率為0.74個對數(shù)級，較單獨(dú)紫外線和氯作用時分別提高了0.34和0.68個對數(shù)級，紫外線劑量增加到40mJ·cm^-2時，滅活率分別提高了0.5和3.24個對數(shù)級。而當(dāng)CT值達(dá)到300mg·min/L時，紫外線劑量為10mJ·cm^-2和40mJ·cm^-2時對枯草芽孢桿菌的滅活率較單獨(dú)紫外線分別提高1.04和2.34個對數(shù)級，與氯消毒提高的幅度更大。并且紫外線照射后再進(jìn)行氯消毒時，對枯草芽孢桿菌的滅活效果要高于二者單獨(dú)作用效果之和。從圖中可以看出，當(dāng)紫外線劑量一定時，提高氯的CT值，對枯草芽孢桿菌的滅活率也隨著增加，但實(shí)際應(yīng)用中，過多的氯投量會增加處理后水中三鹵甲烷的生成量，可以綜合考慮二者的量，以達(dá)到既可以保證一定的消毒效果，同時又降低消毒副產(chǎn)物生成量。

圖3 紫外線和氯對枯草芽孢桿菌的滅活效果
Fig.3 Effect of UV irradiation and chlorine on reduction of Bacillus subtilis spores

　　圖4是先用氯消毒后再用紫外線進(jìn)行照射時對枯草芽孢桿菌的滅活情況。從圖中可以看出，投加氯對紫外線消毒效果影響很小，如CT值為300mg·min/L時，對枯草芽孢桿菌的滅活率只提高了0.61個對數(shù)級，基本上等于氯作用與紫外線作用效果之和。相對于先紫外線照射后投氯的方式，這種方式對枯草芽孢桿菌的滅活效果提高較少。

圖4 氯和紫外線對枯草芽孢桿菌的滅活效果
Fig.4 Effect of chlorine and UV irradiation on the reduction of Bacillus subtilis spores

2.4 紫外線與氯聯(lián)合作用的作用方式探討
　　紫外線照射后，再投加氯消毒明顯提高了對枯草芽孢桿菌的滅活效果，通過Berenbaum公式的計(jì)算，可以得出二者之間的作用關(guān)系。表1是通過公式計(jì)算得到的結(jié)果。從表1中可以看出，在試驗(yàn)的投量（劑量）范圍內(nèi)，計(jì)算結(jié)果均小于1，即二者間有較好的協(xié)同關(guān)系。也就是說，紫外線與氯共同作用是一種相互增強(qiáng)的作用方式。一些研究者研究了不同消毒劑協(xié)同消毒時，認(rèn)為不同消毒劑可能作用于微生物的不同位置，從而增加了微生物對另一種消毒劑的敏感性，因而兩種消毒劑共同作用提高了對微生物的滅活效果^[13]。先經(jīng)過紫外線照射，再進(jìn)行氯消毒時，紫外線可能對芽孢的某些部位造成了損傷，從而有利于后面氯通過芽孢致密的細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)部內(nèi)部，與蛋白質(zhì)發(fā)生氧化作用或破壞磷酸脫氫酶，從而提高了消毒效果，其具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步通過分子生物學(xué)方法進(jìn)一步確定。

用Berenbaum方法計(jì)算的紫外線-氯消毒體系的∑Xi/Yi　　　　 表1
∑Xi/Yi of of UV irradiation and chlorine mixed system　　　 Tab. 1

3. 結(jié)論

　　1．單獨(dú)氯消毒時，對枯草芽孢桿菌的滅活效率較低，采用紫外線消毒技術(shù)，對枯草芽孢桿菌具有較高的滅活效果；
　　 2．采用紫外線與氯聯(lián)用的方式，提高了紫外線對枯草芽孢桿菌的滅活效果，其作用效果高于紫外線和氯單獨(dú)作用的效果之和；紫外線與氯作用的順序?qū)ο拘Ч休^大影響，以先紫外線照射再加氯的效果最好，通過Berenbaum公式計(jì)算可知，二者之間的作用方式是一種協(xié)同作用。
　　 3．通過紫外線與氯的協(xié)同消毒，提高了對枯草芽孢桿菌的滅活效果，二者聯(lián)用還可以降低氯的投量，減少了消毒副產(chǎn)物的生成風(fēng)險，同時保證水的微生物安全性和化學(xué)安全性。

參考文獻(xiàn):

[1] Morris R. D.Chlorination,Chlorination by-products, and Cancer:A Meta-analysis[J]. Amer. J. Public Health. 1992,82:955~963
[2] 劉文君. 給水處理消毒技術(shù)發(fā)展展望. 給水排水[J]. 2004,31（1）:2~5
[3] Frederick W. Pontius. Regulations in 2000 and Beyond[J]. J. AWWA. 2000,92（3）: 40~53
[4] Zhang Xin. Disinfection development: the rise of UV in China. Water 21. 2004,10:18~21
[5] Nicolaa Ballester, James P. Malley Jr. Sequential Disinfection of Adenovirus Type 2 with UV-Chlorine -chloramine[J]. J. AWWA. 2004,96（10）:97~103
[6] Min Cho, Hyenmi Chung, Jeyong Yoon. Quantitative Evaluation of the Synergistic Sequential Inactivation of Bacillus Subtilis Spores with Ozone Followed by Chlorine[J]. Environ. Sci Technol. 2003,37: 2134~2138
[7] Jason L. Rennecker, Amy M. Driedger, Sara A. Rubin, Benito J. Marinas. Synergy in sequential Inactivation of Cryptosporidium Parvum with Ozone/Free chlorine and Ozone/Monochloramine[J]. Wat. Res. 2000,34 （17）:4121~4130
[8] Timothy M. Straub, Charles P. Gerba, Xia Zhou, et. al. Synergistic Inactivation of Escherichia Coli and MS-2 Coliphage by Chloramine and Cupric Chloride[J]. Wat. Res. 1995,29（3）:811~818
[9] Benito Corona Vasquez, Jason L. Rennecker, Amy M. Driedger, Benito J. Marinas. Sequential Inactivation of Cryptosporidium Parvum Oocysts with Chlorine Dioxide Followed by Free Chlorine or Monochloramine. Wat. Research[J]. 2002,36:178~188
[10] Michael A. Butkus, Michael P. Labare, Jeffrey A. Starke, King Moon, Mark Talbot. Use of Aqueous Silver to Enhance Inactivation of Coliphage MS-2 by UV Disinfection. Applied and Environmental Microbiology. 2004,70（5）:2848~2853
[11] James R. Bolton, Karl G. Linden M. ASCE. Standardization of Methods for Fluence（UV Dose） Determination in Bench-Scale UV Experiments. J. Env. Eng. 2003,129（3）:209~215
[12] Timothy M. Straub, Charles P. Gerba, Xia Zhou, et. al. Synergistic Inactivation of Escherichia Coli and MS-2 Coliphage by Chloramine and Cupric Chloride. Wat. Res. 1995,29（3）:811-818

Kouame Y, Haas C. N. Inactivation of E. coli by combined action of free chlorine and monochloramine[J]. Wat. Res. 1991,25（9）:1027~1032